Numero 03/2021
18 Gennaio 2021
Contaminanti della birra: quali sono i principali spoiler di cui dovremmo preoccuparci?
Dal punto di vista della sicurezza, storicamente la birra è sempre stata considerata una bevanda sicura (anche rispetto all’acqua), in quanto in essa non sono stati rilevati agenti patogeni. Ciò è in parte dovuto al fatto che il mosto viene bollito nel bollitore, ma non solo, anche per il livello di alcol, le resine del luppolo ed un basso pH.
Detto questo, alcuni contaminanti microbici, i cosiddetti “spoiler della birra”, possono propagarsi in ogni momento ed essere responsabili di sapori sgradevoli, acidi ed aromi indesiderati, nonché di birre opache e “nebulose”.
Dal punto di vista della fermentazione, sebbene non siano patogeni, questi microrganismi possono anche interferire e competere con il “ceppo di lievito di birra” introdotto per i nutrienti essenziali, rendendo la birra “bloccata in fermentazione” o “troppo attenuata”.
Esistono due gruppi principali di microrganismi responsabili della contaminazione del mosto e della birra:
1. Batteri
2. Lieviti Selvaggi
Di seguito è riportata una panoramica degli spoiler noti (Bokulich 2013). Gli spoiler di birra più comunemente riscontrati sono stati evidenziati con diversi colori: in arancione sono segnalati i batteri lattici, i quali sono ritenuti responsabili del 60-90% delle contaminazioni.
BOKULICH, N.A. AND BAMFORTH, C.W. (2013) THE MICROBIOLOGY OF MALTING AND BREWING. MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGYREVIEWS, 77, 157-172
DANNEGGIAMENTO BATTERICO
Mentre il mosto di birra può essere considerato un brodo microbiologico, la birra stessa dovrebbe essere considerata una bevanda microbiologicamente stabile, grazie alla presenza di etanolo (0,5-10%), i composti amari del luppolo, in particolare gli iso alfa acidi (presenti generalmente a una concentrazione di 17-55 ppm), un alto livello di CO2 (0,5% p / v), un contenuto di ossigeno estremamente basso (<0,1 ppm) che rende la birra un mezzo quasi anaerobico, un pH proibitivamente basso (spesso compreso tra 3,7-4,8), per non parlare del fatto che il profilo nutritivo si esaurisce in seguito alla fermentazione dovuta ai lieviti.
Dal punto di vista della classificazione, i batteri Gram-positivi si incontrano più comunemente, alcuni Gram-negativi possono occasionalmente essere anche responsabili del deterioramento della birra.
I batteri Gram-positivi, la cui parete cellulare trattiene il colorante viola dalla colorazione di Gram rendendoli blu se guardati dal microscopio, generalemente non sopravvivono nella birra e includono potenziali patogeni. Tuttavia, alcune specie dei generi piu comuni come il Lactobacillus e il Pediococcus, spesso denominati batteri lattici (LAB), possono sopravvivere e sono di gran lunga gli spoiler di birra più comunemente riscontrati.
BATTERI LATTICI: ALLEATI O NEMICI?
Alleati: come suggerisce il nome, i batteri lattici producono acido lattico, molto delicato e dal sapore più pulito rispetto all’acido acetico. Le birre di frumento tedesche acide, come la Berliner Weisse e la Gose, sono inacidite con questo tipo di batteri e, naturalmente, si verificano anche nelle fermentazioni lambic.
Nemici: allo stesso tempo, i batteri lattici sono considerati i responsabili del 60-90% delle contaminazioni, aggiundicandosi così il titolo dicontaminante più comune (Back 2003). Queste specie che alterano la birra, mostrano una forte resistenza agli iso alfa acidi del luppolo, denotata dalla presenza dei geni di resistenza al luppolo horA e horC (Suzuki et al 2005).
PERCHÉ È IMPORTANTE DETERMINARE SE I BATTERI LATTICIPOSSEGGONO I GENI DELLA RESISTENZA AL LUPPOLO?
La capacità di differenziare i batteri lattici che possiedono i geni horA e horC, da quelli che invece ne sono privi, è fondamentale sia per il birraio che per il responsabile del controllo qualità, in quanto consente loro di stimare il livello di rischio coinvolto nel deterioramento del prodotto finale. Per esempio, i batteri contenenti geni resistenti costituiscono un vera minaccia per la qualità, mentre i batteri privi di geni sono più un indicatore disinfettante. Attualmente, nella pratica, questa differenziazione può soltanto avvenire tramite dei test basati su PCR (Polymerase Chain Reaction) all’interno di un laboratorio di birra.
QUANTO È FACILE COLTIVARE IL BATTERI LATTICI (LAB) RESPONSABILI DEL DETERIORAMENTO DELLA BIRRA SU UNA PIASTRA DI PETRI?
La facilità e la velocità della crescita dei LAB sono state spesso osservate come variabili sui terreni di rilevamento per il controllo della qualità. Cio vale soprattutto per l’isolamento primario dei ceppi di LAB che deteriorano la birra, il quale porta al fallimento nel rilevamento degli stessi mediante test di controllo qualità nei birrifici (Suzuki 2012). Ciò è in particolar modo dovuto all’adattamento di questi organismi agli ambienti di produzione della birra, il che significa che l’ambiente dei terreni di coltura non è ottimale (ad es. Profilo nutrizionale, pH).
LATTOBACILLI
I lattobacilli sono un genere di batteri a struttura bastoncellare, Gram-positivi, anaerobi facoltativi o microaerofili, non sporigeni.
Tra gli oltre 100 lattobacilli, soltanto 13 o 14 sono quelli riconosciuti come spoiler di birra. Fra questi, il più comunemente riscontrato è il Lactobacillus brevis, eterofermentante (cioè che può produrre alcool o acido lattico dagli zuccheri), il quale cresce in maniera ottimale a 30 °C e pH 4- 6.
Il Lactobacillus lindneri è il secondo più frequentemente riscontrato. Questo e altamente resistente ai composti del luppolo (Back, 1981) e cresce a 19-23 °C (Priest, 1987), riuscendo comunque a sopravvivere a trattamenti termici più elevati rispetto ad altri batteri lattici.
Elenco dei Lattobacilli spoiler
Lactobacillus brevis, lindneri, buchneri, parabuchneri, casei, coryneformis, malefermentans, curvatus…
I lattobacilli risultano spesso difficili da coltivare su molti terreni di rilevamento di laboratorio utilizzati nell’industria della birra e spesso, se non rilevati dal controllo di qualità microbiologico, causa di deterioramento. È stato osservato che, se esposti esposti a stress (alcol, pH basso, resine di luppolo …), i lattobacilli entrano in una fase latente, durante la quale mantengono il proprio stato vitale ma non sono coltivabili (viable but not cultivable – VBNC).
Inoltre, la microbiologia tradizionale non è in grado di stabilire se questi batteri possiedono o meno i geni di resistenza al luppolo (hor A e hor C). Tuttavia, questo è fondamentale da sapere, in quanto ciò determinerà la capacità di questi batteri non solo di sopravvivere nella birra, ma anche di moltiplicarsi e rovinare la birra in un secondo momento.
PEDIOCOCCHI
Batteri Gram-positivi, anaerobici facoltativi con proprietà omo-fermentative (converte il glucosio per produrre acido lattico). Tuttavia, i prodotti finali metabolici variano a seconda delle condizioni fornite, tipicamente il Pediococcus deteriora la birra producendodiacetile come sottoprodotto principale.
Elenco dei Pediococchi spoiler
Pediococcusdamnosus, acidilactici, pentosaceus, , parvulus, inopinatus, halophilus, dextrinicus, and urinaeequi.
P. damnosus cresce ad una temperatura piuttosto bassa e la sua temperatura ottimale è compresa tra 22-25 ° C. A causa della sua capacità di crescere anche a basse temperature, il deterioramento può verificarsi nella fase di fermentazione e maturazione così come in bottiglia. La contaminazione da Pediococcus è anche un problema nell’aggiunta dei lieviti, poiché si ritiene che i batteri si leghino alla cellula di lievito con un legame molto forte.
Inoltre, questi batteri possono o meno possedere i geni di resistenza al luppolo (hor A e hor C) che non possono essere rilevati dalla microbiologia tradizionale ma che è importante sapere in quanto ciò determinerà la loro capacità non solo di sopravvivere nella birra ma anche di moltiplicarsi e rovinare la birra in un secondo momento.
BATTERI GRAM-NEGATIVI
Si è scoperto che solo pochi batteri Gram-negativi sono responsabili del deterioramento della birra. Questi batteri si dividono in due categorie:
1. Anaerobi obbligati dei generi Pectinatus, Megasphaera e Zymophilus, i più comunemente riscontrati
2. Batteri Gram-negativi aerobi e anaerobi facoltativi, come i batteri dell’acido acetico (AAB), Zymomonas e alcune specie di Enterobacteriaceae.
ANAEROBI OBBLIGATI: BATTERI DI GENERE PECTINATUS E MEGASPHAERA.
Questi batteri Gram-negativi anaerobici si incontrano molto meno frequentemente come organismi che alterano la birra rispetto ai batteri lattici. Tuttavia, a differenza dei batteri lattici, quando presenti, i batteri Gram-negativi anaerobici sono considerati contaminantiobbligati della birra (Sakamoto e Konings, 2003) e denotano la presenza di contaminazione, che deve essere assolutamente affrontata. Questi batteri sono in grado di trovare nicchie adeguate nei birrifici, dove possono sopravvivere per anni senza causare difetti evidenti (Hakalehto, 2000). Spesso a causa di alcuni problemi tecnici o di una pulizia inadeguata, ciò puòportare alla contaminazione e quindi al deterioramento della birra.
• I Pectinatus sono bastoncini mobili diritti o leggermente curvi che si presentano generalmente come cellule singole o in coppia. Il nome del genere deriva dal latino “pecten“ = pettine, poiché la forma che li caratterizza è quella di un pettine, i denti, numerati da 1 a 23, sono situati solo su un lato della cellula. Crescono ad una temperatura che va dai 15 ai 40 ° C, con un valore ottimale a 28–32 ° C. Non sopravvivono a temperature superiori ai 50 ° C.
Rischio insorgenza nei birrifici: Birra non pastorizzata a bassa gradazione alcolica (<5%), area di imbottigliamento birra, biofilm
Sapori/aromi sgradevoli: Uovo marcio, odore sgradevole
Prodotti metabolici: Acido acetico, acido propionico, acido lattico, acido succinico, H2S, acetoina, metil mercaptano e altri composti dello zolfo
• Le Megasphaere sono batteri che hanno la forma di cocci leggermente ovali e si presentano singolarmente o in coppia.
Se ne distinguono cinque specie, di cui le Megasphaera cerevisiae, Megasphaera paucivorans e Megasphaera sueciensissi trovano solo in corrispondenza di birre contaminate.
Rischio insorgenza nei birrifici: Birra non pastorizzata a bassa gradazione alcolica (<5%), area di imbottigliamento birra, biofilm Sapori/aromi sgradevoli: odore sgradevole Prodotti metabolici: H2S, acido butirrico, acido isobutirrico, acido caprioco, acido valerico, acido isovalerico
• Il Selenomonas comprende attualmente 10 specie, di cui solo una, Selenomonas lacticifex, è stata rilevata in associazione con lieviti contaminati (Schleifer et al., 1990), e solo più recentemente anche sulle superfici di impianti d’imbottigliamento (Vávrová et al., 2014). Rischio insorgenza nei birrifici: Lieviti riutilizzati Sapori/aromi sgradevoli: odore sgradevole Prodotti metabolici: Acido acetico, lattico e propionico
• Il genere Zymophilus comprende due specie di batteri, Zymophilus paucivorans e Zymophilus raffinosivorans, sempre presenti nelle operazioni di birrificazione, specialmente nel lievito di birra e negli scarti della produzione. Il Zymophilus deriva dal greco “zyme” = lievito e “philos” = amante (Schleifer et al., 1990). I batteri del genere Zymophilus sono dritti o leggermente ricurvi, a bastoncelli mobili elicoidali che si presentano generalmente come singoli o in coppia, o meno frequentemente in brevi catene. Rischio insorgenza nei birrifici: Lieviti riutilizzati o scarti di birra Sapori/aromi sgradevoli: odore sgradevole Prodotti metabolici: Acido acetico, lattico e propionico
BATTERI ACETICI
I batteri acetici sono dotati di intenso metabolismo ossidativo e metabolizzano gli zuccheri e l’etanolo per via ossidativa, producendo acido acetico. Questa famiglia di batteri Gram-negativi (Acetobacteriaceae) comprende circa 10 generi, di cui i più comuni sono Acetobacter, Gluconobacter e Gluconacetobacter. Questi microrganismi sono ampiamente diffusi in ambienti contenenti zuccheri, alcool e acidi, come la birra, il vino, l’aceto, il sidro, nella produzione di cibi fermentati, su piante, frutti e nell’aria, e, se in presenza di ossigeno, sono causa di grave deterioramento della birra. Poiché sono tolleranti agli acidi, all’etanolo e non sono inibiti dai composti del luppolo, crescono rapidamente nella birra, producendo aromi acidi e torbidità. Tuttavia, finché la birra viene conservata correttamente e a livelli di ossigeno bassi, i batteri acetici non costituiscono un grave problema. Proprio per questo motivo, sono quelli che piu comunemente causano problemi nella birra invecchiata in botte, durante la fase di erogazione.
• Tra tutte le specie convalidate di batteri acetici, nel genere dell’Acetobacter ne sono state identificate dieci associate alla produzione della birra; in particolare, Acetobacter aceti, Acetobacter liqueficiens, Acetobacter pastorianus e Acetobacter hansii sono quelli che si trovano piu frequentemente nei birrifici. Rischio insorgenza nei birrifici: Mosto, birra stoccata e birre invecchiate in botte, biofilm Sapori/aromi sgradevoli: Sapore acido, aceto Prodotti metabolici: Acido acetico • Fra le varie specie incluse nel genere del Glucanobacter, soltanto quella de Gluconobacter oxydansè stata spesso associata agli ambienti di produzione della birra, insieme ai Gluconobacter cerevisiae, seppur meno frequenti. Rischio insorgenza nei birrifici: Mosto, birra stoccata e birre invecchiate in botte Sapori/aromi sgradevoli: Sapore acido, aceto Prodotti metabolici: Acido acetico, acetato • I batteri di Zymomonas si presentano come bastoncini corti e rotondi, singoli o in coppia, talvolta in catene o rosette. Questi batteri sono Gram-negativi, non formano endospore e catalasi positivi. Gli zymomonas sono di natura aerotollerante e anaerobica facoltativa. Gli Zymomonas tollerano l’etanolo (sotto il 10% di etanolo v / v) e crescono in modo ottimale a pH superiori a 3,4 e a temperature tra i 25 °C e i 30 °C. Rischio insorgenza nei birrifici: Birre carbonate (non si trovano nelle lager) Sapori/aromi sgradevoli: Fruttato, mela marcia, uovo marcio Prodotti metabolici: Acetaldeide e H2S
LE ENTEROBATTERIACEE La famiglia delle Enterobacteriaceae comprende una grande varietà di batteri Gram-negativi aerobi e anaerobi facoltativi a forma di bastoncino, asporigeni, ossidasi negativi. Diverse specie appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae come quella dei Klebsiella, Citrobacter, Obesumbacterium e Hafnia sono associate al deterioramento del mosto non fermentato e in fermentazione. Gli enterobatteri sono in grado di utilizzare lattosio con formazione di gas e acido a 35 °C – 37 °C entro 48 ore. Questi batteri normalmente non sono in grado di crescere nella birra finita, ma si trovano occasionalmente nelle fasi iniziali nel processo di fermentazione, causando sapori sgradevoli nel prodotto finale. I batteri coliformi sono indicatori delle condizioni igieniche e del livello di igiene nei birrifici.
• I batteri contaminanti Obesumbacterium spp sono stati identificati nel lievito di birra e nel mosto di fermentazione, tuttavia, data la loro incapacità di crescere al di sotto del pH 3,9, questi non sono mai stati rilevati nella birra. Durante il processo di fermentazione Obesumbacterium proteus cresce rapidamente e di conseguenza abbassa il tasso di fermentazione, portando così ad un prodotto di qualità inferiore. Inoltre, la crescita di quest’ultimo durante la fermentazione è nota per la conseguente produzione di metaboliti come dimetilsolfossido (DMS), il quale è responsabile del sapore tipo pastinaca, acetoina, acido lattico, propanolo, isobutanolo e 2, 3-butandiaolo. Rischio insorgenza nei birrifici: Lieviti riutilizzati e fermentazione del mosto Sapori/aromi sgradevoli: Pastinaca, odore di zolfo Prodotti metabolici: Dimetil solfuro (DMS), diacetile, alcoli superiori, N-nitrosammine, acetoina
LIEVITI SELVAGGI
Un lievito selvaggio, per definizione, è un lievito che “non è stato utilizzato deliberatamente e sotto pieno controllo”. Si riferisce in maniera approssimativa ad una categoria generica posizionata al di fuori di quella individuata dai classici lieviti ad alta fermentazione e spesso deriva dall’ambiente. Ad eccezione della Lambic e di altre birre a fermentazione spontanea, i lieviti selvaggi sono considerati organismi deterioranti nella produzione della birra e devono essere evitati a tutti i costi. Va comunque sottolineato che non tutti i lieviti selvaggi danneggiano la birra, ma la loro presenza indica un’infezione e un problema di natura sanitaria nel birrificio. Quando si parla di “lieviti selvaggi”, i ceppi più significativi applicati o applicabili al settore birra sono i “lieviti Saccharomyces” e “lieviti non Saccharomyces”.
LIEVITI NON-SACCHAROMYCES
LIEVITO BRETTANOMYCES / DEKKERA
Il genere Brettanomyces fu isolato per la prima volta in Gran Bretagna (1904) [GrekBrettano[birraio britannico] e Myces [fungo]]. Brettanomyces è la variante asessuata (non sporigena), mentre Dekkera è la controparte telemorfica (sessuale). Attualmente sono descritte 5 specie di Brettanomyces. Brettanomyces (Brett) è in grado di resistere ad alti livelli di alcol e può anche crescere in ambienti con ossigeno limitato e in un ambiente a basso pH, il che significa che è in grado di prosperare in ambienti di fermentazione alcolica. È anche in grado di fermentare gli zuccheri in condizioni aerobiche (noto come effetto Crabtree) e riesce competere con altri microbi grazie alla sua capacità di produrre acido acetico in condizioni aerobiche. Brett è anche in grado di battere S. cerevisiae in determinate condizioni di fermentazione e può metabolizzare un’ampia gamma di fonti di carbonio, come maltosio e fruttosio, ma anche glucosio e zuccheri complessi che non sono prontamente utilizzati da S. Cerevisiae, come il cellobiosio e destrine che danno luogo a birre “super attenuate”, che presentano livelli alcolici più alti e concentrazioni di zucchero più basse. Altri lieviti non-Saccharomyces sono in grado di crescere nella birra e sono stati quindi occasionalmente osservati, ad esempio i Pichia spp, Candida spp, Torulaspora delbrueckii e Zygosaccharomyces.
In generale, il rischio di deterioramento è limitato in condizioni ottimali, grazie all’accesso limitato di ossigeno, alla tossicità dell’etanolo e alla competizione per i nutrienti con Saccharomyces. La maggior parte di questi lieviti può essere trovata in tutto il birrificio, in particolare nelle valvole di assaggio sporche e su altre superfici a contatto con la birra. Producono sapori sgradevoli (specialmente acidi organici e POF), torbidità, sedimenti o film superficiali. Dovrebbero essere considerati contaminanti opportunistici, che causano deterioramento quando le condizioni sono favorevoli, ma generalmente non costituiscono un problema nelle pratiche moderne di produzione della birra. Questi lieviti sono più un problema nelle birre fermentate in botte, dove l’ingresso di ossigeno stimola la loro crescita, da qui la necessità di limitare lo spazio tra l’ambiente interno alla botte e quello esterno, durante la fase di maturazione.
LIEVITI SELVAGGI SACCHAROMYCES
La contaminazione incrociata con un ceppo di S. cerevisiae diverso da quello previsto può causare difetti di sapore e prestazioni di fermentazione insolite. Il lievito selvatico Saccharomyces più problematico e molto discusso è il Saccharomyces diastaticus, identificato solo da alcuni anni come contaminante e rilevato in tutto il mondo nell’industria birraria. Il Saccharomyces diastaticus, come suggerisce il nome, è una variante di S. cerevisiae che possiede il gene STA (1, 2 o 3). Questi geni inducono il lievito a produrre un enzima chiamato glucoamilasi, il quale è in grado di idrolizzare i carboidrati più complessi, in particolare la destrina in zuccheri semplici, con conseguente iper attenuazione. Ciò si traduce generalmente in: • Iper attenuazione (> 90%) e / o fermentazione secondaria
• Sovracarbonatazione (osservata come “zampillo” al momento dell’apertura della bottiglia / lattina / fusto)
• Sapori sgradevoli
Possibili cause diSaccharomyces diastaticus:
• Scarsa igiene:
o Presso stabilimento di imbottigliamento / inscatolamento (> 70% dei casi segnalati) [Meier-Dörnberg 2017]
o Presso il Birrificio
o Nel serbatoio di fermentazione
o Presso la zona di stoccaggio
• Materiali grezzi:
o Lievito
o Luppolo (es. Dry hopping)
NB. Alcuni lieviti diastaticus possono essere utilizzati per produrre birre complesse e interessanti, le birre “Saison style” ne sono il perfetto esempio. La manipolazione di questi lieviti in un birrificio richiede cura e un piano di controllo della qualità ben congegnato, al fine di evitare la contaminazione incrociata.
INFORMAZIONI CHIAVE
• I batteri lattici [LAB] (lattobacilli e pediococchi) sono responsabili del 60-90% dei problemi di “spoiler di birra”.
• Ci sono più di 100 specie di lattobacilli, ma oggi solo 14 o più lattobacilli sono riconosciuti come “spoiler di birra”.
• I LAB sono difficili e lenti (2-4 giorni) da coltivare su terreni QC a causa del loro profondo adattamento all’ambiente della birra, con il rischio di risultati falsi negativi.
• La presenza di geni di resistenza al luppolo hor A e hor C in LAB è percepita come un indicatore affidabile per quanto riguarda la gestione del rischio e può essere rilevata solo con metodi PCR
• I batteri anaerobici (Megasphaera spp. ePectinatusspp.) si riscontrano generalmente solo nelle birre <5% di alcol e in condizioni di ossigeno molto basso. Tuttavia, quando presenti, sono considerati un patogeno obbligato.
• Il Saccharomyces var diastaticus è il più comunemente responsabile dello “zampillo” dovuto a fermentazioni indesiderate di 2° grado. La fonte di contaminazione può provenire principalmente dal lievito o dall’interno del birrificio stesso una volta stabilito.
• I “lieviti selvatici” (cioè Brettanomyces / Dekkera) sono problematici per il fatto che resistono a livelli elevati di alcol, crescono sia in ambienti limitati di ossigeno che a pH basso, il che significa che sono in grado di prosperare nella birra.
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BIBLIOGRAFIA
Back W. 1981. Bierschadliche Bakterien – Taxonomie der bierschaldlichen Bakterien. Monatsschrift furBrauerie, 34
Back W. 2003. Bioflime in der Brauerie und Getrankeindustrie – Brauwelt Online 23/25 1-5
Hill A.E 2015. Brewing Microbiology – 1st Edition
Meier-Dörnberg, T., Jacob, F., Michel, M., &Hutzler, M. (2017). Incidence of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus in the Beverage Industry: Cases of Contamination , 2008 – 2017, 54(4), 140–148.
Priest F.G. 1987. Brewing Microbiology. Elsevier Applied Science
Suzuki K et al 2005. Isolation of hop-sensitive variant from Lactobacillus lindneri and identification of genetic marker for beer spoilage ability of lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 71, 5089-5097
Suzuki K. 2012. 125th Anniversary review. Microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria. Journal of the institute of brewing, 117
